ZNF281對結直腸癌細胞侵襲與遷移的影響

　　方法選取本院2014年6月至2016年6月收治的50例結直腸癌患者的癌灶標本及20例癌旁正常黏膜標本，比較不同標本中ZNF281的表達情況，利用Transwell小室觀(guān)察ZNF281對結直腸癌細胞侵襲與遷移能力的影響，并分析ZNF281與臨床病理指標的關(guān)系。

　　結果ZNF281在結直腸癌標本中的陽(yáng)性表達率為84.00%，在癌旁正常黏膜中陽(yáng)性表達率為20.00%，且幾乎無(wú)強陽(yáng)性表達，差異具有顯著(zhù)性（P＜0.05）。Transwell小室侵襲檢測結果提示，ZNF281高表達組穿膜細胞數明顯高于ZNF281低表達組和ZNF281陰性表達組（P＜0.05）；Transwell小室遷移檢測結果提示，ZNF281高表達組穿膜細胞數明顯高于ZNF281低表達組和ZNF281陰性表達組（P＜0.05）。ZNF281表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），但其在結直腸癌不同分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況及Duke's分期方面均具有顯著(zhù)差異（P＜0.05）。

　　結論ZNF281在結直腸癌組織中表達水平升高，且不同病理分化程度組織中ZNF281表達有顯著(zhù)差異。ZNF281可能參與結直腸癌的發(fā)生，同時(shí)可影響癌細胞的遷移能力，檢測ZNF281表達對結直腸癌的診斷、治療及預后具有一定臨床意義。

　　關(guān)鍵詞：鋅指蛋白281；結直腸癌；侵襲；遷移

　　結直腸癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率、高死亡率及低治愈率的特點(diǎn)[1]。近年來(lái)雖然結直腸癌的診斷和治療較既往有了很大進(jìn)步，但患者總體生存率并未得到明顯改善，5年生存率約為55%，尤其對于晚期結直腸癌，多伴有遠處轉移，患者預后極差[2]。目前臨床多采用外科治療結直腸癌，通過(guò)根治性切除癌灶，以緩解該病進(jìn)展。研究顯示，僅70%的結直腸癌患者可行直腸癌根治術(shù)治療，且此類(lèi)患者的預后與腫瘤病理學(xué)分期具有相關(guān)性，通常將是否伴有淋巴結轉移作為預測患者預后的因素[3，4]?；虬邢蛑委熆赏ㄟ^(guò)特定基因靶點(diǎn)抑制腫瘤細胞表達，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用，是目前治療腫瘤的新策略[5]。鋅指蛋白（zincfingerprotein，ZNF）是指與Zn2+結合的一類(lèi)蛋白質(zhì)，其可選擇性結合于特異的靶結構，在基因表達調控、細胞分化及胚胎發(fā)育等過(guò)程中具有重要作用[6]。

　　ZNF281是ZNF的亞型，該蛋白在腫瘤惡性增殖或病變細胞中呈現高表達[7]。本研究分析了ZNF281對結直腸癌細胞侵襲與遷移的影響，旨在探討ZNF281表達與結直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，具體報道如下。

　　1、資料與方法

　　1.1、資料

　　50例結直腸癌標本和20例癌旁正常黏膜標本均取自2014年6月至2016年6月于本院行手術(shù)治療的結直腸癌患者，其中，男29例，女21例；年齡27～80歲，平均（56.4±12.5）歲。入組標本均行病理切片檢查確診為結直腸癌，患者術(shù)前均未接受放、化療或其他腫瘤綜合治療。標本組成：直腸癌21例，結腸癌29例，癌旁正常黏膜20例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì )審核批準，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

　　1.2、方法

　　1.2.1、標本采集及處理

　　經(jīng)手術(shù)獲取癌灶組織和癌旁正常黏膜組織，生理鹽水沖洗3次，置于10%中性甲醛溶液中固定48小時(shí)，常規脫水后石蠟包埋，制成4.0μm厚度的切片，而后對切片行HE染色，進(jìn)行病理學(xué)診斷分析。

　　1.2.2、ZNF281表達檢測

　?、偃?片石蠟包埋后的切片進(jìn)行ZNF281免疫組織化學(xué)染色，切片于60℃孵箱中加熱1小時(shí)，脫蠟、水化，除去內源性過(guò)氧化物酶，將組織非特異性抗原封閉?？贵w標記：一抗選用兔抗人ZNF281單克隆抗體（上海瑞齊生物科技有限公司生產(chǎn)，濃度為99%，具體使用方法參照說(shuō)明書(shū)），4℃孵育1小時(shí)；二抗選用經(jīng)生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白G（北京意宏安生物科技有限公司生產(chǎn)，濃度為0.5mg/ml，具體使用方法參照說(shuō)明書(shū)），37℃孵育30分鐘。②2名病理科主治醫師采用雙盲法獨立閱片，ZNF281表達的評定主要依據組織染色強度和顯色比例。評分標準：1分：顯色陽(yáng)性細胞數占總細胞數的百分比＜11%；2分：顯色陽(yáng)性細胞數占總細胞數的百分比為11%～50%；3分：顯色陽(yáng)性細胞數占總細胞數的百分比為51%～80%；4分：顯色陽(yáng)性細胞數占總細胞數的百分比＞80%。依據染色強度進(jìn)行評分：1分：弱染色；2分：中等染色；3分：強染色。依據顯色和染色強度將結果分為3級：無(wú)論染色強度如何，其顯色比例評分≤1分為陰性（－），評分為2～3分為弱陽(yáng)性（＋），評分為4～7分為強陽(yáng)性［（＋＋）～（＋＋＋）］。

　　1.2.3、Transwell侵襲與遷移實(shí)驗

　　結直腸癌細胞（HCT116）由中國科學(xué)院上海細胞庫提供，置于含有10%胎牛血清培養液（江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司）中，于37℃、5%CO2溫箱內培養，用0.25%濃度的胰蛋白酶消化常規傳代（細胞培養4代后）。將結直腸癌細胞傳代接種于無(wú)菌6孔板中，濃度為100個(gè)/100μl，待細胞貼壁后，用無(wú)血清培養液（江陰劍橋生物技術(shù)有限公司）培養，同時(shí)各取250μl無(wú)血清的培養液分別稀釋ZNF281過(guò)表達的質(zhì)粒（分為陰性表達、低表達及高表達，由南京德享文生物技術(shù)公司提供），靜置10分鐘后輕柔混勻，再次靜置10分鐘后加入細胞上清液中，6小時(shí)后換為完全培養液（江陰劍橋生物技術(shù)有限公司提供）繼續培養48小時(shí)進(jìn)行后續實(shí)驗。①侵襲實(shí)驗：將上述細胞重懸于無(wú)血清培養液中，以5×104個(gè)/孔的密度加入預先鋪好Matrigel膠的Transwell小室上室內，向下室加入500ml完全培養液，于37℃、5%CO2的溫箱培養24小時(shí)后用多聚甲醛（金錦樂(lè )化學(xué)有限公司，濃度為96%）固定，0.01%結晶紫（索萊寶公司）染色，于200倍光學(xué)顯微鏡（上海比目?jì)x器有限公司，全相顯微鏡10XB）下計數穿膜細胞數，取5個(gè)視野，計算平均值，每組實(shí)驗設3個(gè)復孔，重復3次。②遷移實(shí)驗：將上述細胞重懸于無(wú)血清培養液中，以5×104個(gè)/孔的密度加入Transwell小室上室內，向下室加入500ml完全培養液，于37℃、5%CO2的溫箱中培養24小時(shí)后用多聚甲醛（濃度為4%）固定，0.01%結晶紫染色，于200倍光學(xué)顯微鏡下計數穿膜細胞數，取5個(gè)視野，計算平均值，每組實(shí)驗設3個(gè)復孔，重復3次。

　　1.3、統計學(xué)方法

　　采用SPSS15.2軟件進(jìn)行數據統計分析。計量資料以x±s表示，比較采用t檢驗；計數資料以%表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有顯著(zhù)性。

　　2、結果

　　2.1、ZNF281在結直腸癌和癌旁正常黏膜標本中的表達情況比較

　　ZNF281在結直腸癌標本中陽(yáng)性表達率為84.00%，在癌旁正常黏膜中陽(yáng)性表達率為20.00%，且幾乎無(wú)強陽(yáng)性表達，比較差異具有顯著(zhù)性（P＜0.05）（表1）。陰性表達組穿膜細胞數為（132±10）個(gè)/視野，ZNF281高表達組穿膜細胞數明顯多于ZNF281低表達組和ZNF281陰性表達組（P＜0.05）。

　　2.2、ZNF281對結直腸癌細胞侵襲能力的影響

　　Transwell小室檢測結果提示，ZNF281高表達組穿膜細胞數為（215±13）個(gè)/視野，ZNF281低表達組穿膜細胞數為（165±10）個(gè)/視野，ZNF281陰性表達組穿膜細胞數為（57±8）個(gè)/視野，ZNF281高表達組穿膜細胞數明顯多于ZNF281低表達組和ZNF281陰性表達組（P＜0.05）。

　　2.3、ZNF281對結直腸癌細胞遷移能力的影響

　　Transwell小室檢測結果提示，ZNF281高表達組穿膜細胞數為（418±23）個(gè)/視野，ZNF281低表達組穿膜細胞數為（327±18）個(gè)/視野，ZNF281陰性表達組穿膜細胞數為（132±10）個(gè)/視野，ZNF281高表達組穿膜細胞數明顯多于ZNF281低表達組和ZNF281陰性表達組（P＜0.05）。

　　2.4、ZNF281表達與結直腸癌各臨床病理學(xué)指標的相關(guān)性分析

　　ZNF281表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），但ZNF281表達水平在結直腸癌不同分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況及Duke's分期方面均具有顯著(zhù)差異（P＜0.05）（表2）。

　　3、討論

　　研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，且為多步驟、多基因突變等共同引發(fā)的疾病[8]。結直腸癌作為臨床常見(jiàn)的消化系統惡性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展過(guò)程也具有明顯的階段性，通常由正常的上皮經(jīng)不典型增生形成腺癌、原位癌，最后出現浸潤，發(fā)生遠處轉移[9，10]。隨著(zhù)分子生物學(xué)的發(fā)展，目前對于結直腸癌的研究已達到分子水平，有學(xué)者發(fā)現結直腸癌是由多個(gè)基因變異引起的。目前被普遍認可的結直腸癌分子途徑主要包括4條：①抗原提呈細胞—β-catenin—Tcf—Myc途徑；②HNPCC通路；③潰瘍性結腸炎發(fā)生—細胞不典型增生—癌變通路；④基因的過(guò)度甲基化引起雌激素失活[11-13]。

　　ZNF281為ZNF家族中的一個(gè)亞型，是真核生物中存在的細胞因子，可誘導乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉換等侵襲行為。最新研究發(fā)現，ZNF281在結直腸癌細胞中也有表達，并發(fā)現其可通過(guò)干預目的基因的轉錄，調控特定基因表達的時(shí)間特異性和組織特異性，對細胞的生長(cháng)、分化、凋亡及其他過(guò)程產(chǎn)生重要影響[14，15]。ZNF281具有誘發(fā)或抑制腫瘤的作用，研究發(fā)現ZNF281的表達通常伴有細胞的增殖，其在體外培養的成纖維細胞和腸上皮細胞中是一種可發(fā)揮促增生作用的調控因子[16，17]。但ZNF281也有一定的抑制細胞增殖的作用，研究發(fā)現ZNF281在前列腺癌和乳腺癌中可下調或者缺失[18]。本研究結果顯示，ZNF281在結直腸癌標本中陽(yáng)性表達率為84.00%，在癌旁正常黏膜中陽(yáng)性表達率為20.00%，且幾乎無(wú)強陽(yáng)性表達，差異具有顯著(zhù)性。ZNF281表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位均無(wú)相關(guān)性，但ZNF281表達水平在不同分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移情況及Duke's分期方面均具有顯著(zhù)差異。結果提示，ZNF281在結直腸癌病變的發(fā)生、發(fā)展階段存在高表達，在一定程度上可說(shuō)明ZNF281可能是影響結直腸癌發(fā)生、發(fā)展的因素之一。

　　近年來(lái)，隨著(zhù)人們生活習慣和飲食結構的改變，結直腸癌的發(fā)病率不斷升高，該病晚期多伴有遠處轉移。由于缺乏特異性較高的治療藥物是目前臨床治療的難點(diǎn)[19，20]，本研究通過(guò)體外侵襲與遷移實(shí)驗，了解ZNF281對結直腸癌細胞侵襲與遷移能力的影響，結果顯示，在結直腸癌細胞侵襲與遷移能力方面，ZNF281高表達組穿膜細胞數均明顯多于ZNF281低表達組和ZNF281陰性表達組，說(shuō)明ZNF281高表達可提高結直腸癌細胞的侵襲與遷移能力。因此，臨床通過(guò)抑制ZNF281的表達可能抑制結直腸癌細胞的侵襲與遷移能力。

　　綜上所述，ZNF281在結直腸癌組織中表達水平升高，且在不同病理分化程度中表達存在差異。ZNF281可能參與結直腸癌的發(fā)生，同時(shí)可影響癌細胞的遷移能力，可能成為治療結直腸癌的新靶點(diǎn)。因此，檢測ZNF281表達對結直腸癌的診斷、治療及預后具有一定的臨床意義。