上個(gè)月，2018諾貝爾生理學(xué)或醫學(xué)獎授予了美國的JamesAllison和日本的TasukuHonjo教授，以表彰兩位及其團隊在腫瘤免疫治療上的巨大貢獻。

以PD-1單克隆抗體為代表的免疫療法，自2014年誕生以來(lái)，讓全世界都見(jiàn)識到了其在腫瘤治療方面的巨大潛力。一時(shí)間，國內外藥企加入了這條研發(fā)賽道，各家PD-1或初戰告捷或蓄勢待發(fā)。已登陸的O藥和K藥不消多說(shuō)，就是處于在研階段的新藥也如恒河沙數。

面對這些如雨后春筍般涌現的同類(lèi)藥物，除了臨床試驗以外，就沒(méi)有其他評價(jià)方式來(lái)幫助我們評價(jià)它們的好壞嗎？

當然不是。要知道從雜交瘤技術(shù)出現至今，治療性單克隆抗體的制備技術(shù)已經(jīng)數次迭代，單抗“生來(lái)如何”基本決定了能走多遠，我們也擁有了一套通用的臨床前評估標準，可以借此對藥物在臨床上的表現作出預估。

今天咱們就以幾個(gè)國內外的PD-1抑制劑為例，來(lái)嘮嘮單抗的制備技術(shù)和臨床前特征。想講清楚這其中的故事，還得從單抗的結構說(shuō)起，畢竟結構是功能的基礎嘛。

絕大多數治療性抗體都是IgG。IgG由四條肽鏈組成，兩重兩輕，每條鏈又可分為恒定區（CH/CL）與可變區（VH/VL），這就是抗體最基礎的結構了。

在這個(gè)基礎上，每個(gè)可變區內又存在三個(gè)短多肽鏈形成的互補決定區（CDR），與可變區的其他部分相比，CDR序列可變性更高?？梢哉f(shuō)可變區決定了抗體的抗原結合能力，而CDR又是核心中的核心。

抗體的結構還有另一種分法，就是可結晶片段（Fc）+抗原結合片段（Fab），這個(gè)也有用處，我們后面說(shuō)

說(shuō)起來(lái)抗體的結構還真是挺復雜的，不是人力可以完美仿造的。要知道，抗體的多個(gè)結構域都是相對獨立、模塊化的，每個(gè)部分的組成都在基因組中有復數的備份，特別是CDR，CDR自己可以分為V、D、J三種片段，它們的組合給了CDR超級豐富的變化，我們把這叫做VDJ重組。

這還不是最大的“殺器”。當被抗原激活，生產(chǎn)抗體的B細胞開(kāi)始迅速增殖，它們編碼可變區的基因將會(huì )以遠超其他細胞的速度開(kāi)始突變，這種名為體細胞超突變（SHM）的過(guò)程使得B細胞每一次分裂產(chǎn)生的后代都微妙地有所不同。隨后，輔助T細胞則會(huì )對B細胞進(jìn)行進(jìn)一步選擇，只有那些產(chǎn)生高親和力抗體的B細胞才能獲得資源存活下來(lái)，這個(gè)過(guò)程叫親和力成熟。

免疫系統的大智慧還有更多，咱們今天了解這些就夠了。所以說(shuō)，機體內能夠以一套極其高效率的程式快速瞄準抗原生產(chǎn)具有足夠治療效率的抗體，這是體外“手工”優(yōu)化比不了的。

不過(guò)也好在抗體這種樂(lè )高一樣的模塊化結構，這給了我們借助科技改造它的機會(huì )。

人類(lèi)對抗體的了解實(shí)在是走得太慢了。十九世紀末，才有科學(xué)家模模糊糊摸到了體液免疫的衣擺，又過(guò)了一百年，第一個(gè)單抗藥物才正式面世。不過(guò)后面的故事我們也知道，這款藥物之后，FDA9年沒(méi)敢再碰單抗，沒(méi)有別的原因，就是副作用太大了，病人消受不起。

最早的蛇毒血清其實(shí)是馬的血清，幸運的是你很難被同一種毒蛇咬兩次，單抗藥物就不一樣了，一般來(lái)說(shuō)只要用了就得是持續使用。

第一個(gè)單抗藥得益于當時(shí)出現不久的雜交瘤技術(shù)，單純來(lái)說(shuō)它就是一種小鼠產(chǎn)生的、小鼠自己的抗體，首先它不一定完美契合人類(lèi)抗原，其次給人輸進(jìn)去，人體也會(huì )產(chǎn)生針對它的抗藥抗體（ADA），好一點(diǎn)就是越用越?jīng)]用，壞一點(diǎn)再引發(fā)個(gè)超敏反應，病人性命堪憂(yōu)。

從此科學(xué)家開(kāi)始了從鼠到人的探索。

這里抗體的模塊化結構就派上用場(chǎng)了。起先科學(xué)家是把小鼠抗體的可變區揪下來(lái)，和人類(lèi)抗體的恒定區連在一起，這樣生成的單抗實(shí)際上60%到70%都是人類(lèi)的了，免疫原性已經(jīng)大大降低了，這就是嵌合抗體的誕生。

現代的抗體制備技術(shù)已經(jīng)又前進(jìn)了兩步了，一是替換程度已經(jīng)精細到CDR的人源化抗體，一是全人源抗體。人源化抗體已經(jīng)有90%以上都是人類(lèi)的了，全人源則故名思義，百分百人類(lèi)，理論上幾乎不會(huì )引發(fā)不必要的免疫反應。

這里還可以教大家一個(gè)從名識類(lèi)別的小訣竅。單抗們的通用名都巨老長(cháng)，一眼看過(guò)去令人頭昏眼花，咱們可以把它們拆一拆。首先最末尾的mab大家肯定都曉得了，就是單抗的意思，再往前看兩個(gè)字母，這里邊就藏著(zhù)大秘密。根據單抗命名法則，這倆字母如果是xi，那它就是個(gè)嵌合抗體；如果是zu，說(shuō)明是一種人源化抗體；如果只有一個(gè)u，那恭喜你了，這是一款全人源抗體。

舉個(gè)例子，剛來(lái)中國不久的O藥和K藥，前者通用名nivolumab，可見(jiàn)是個(gè)全人源單抗，后者pembrolizumab，咱們就知道它是個(gè)人源化抗體了。

從人源化到全人源，雖說(shuō)只是不到10%的差異但卻難比登天，畢竟我們不能直接免疫人體獲得抗體。

在這里科學(xué)家們選擇了兩條截然不同的道路——噬菌體展示和轉基因小鼠。前者利用了噬菌體/原核生物傳代快的優(yōu)勢，通過(guò)體外抗原抗體結合能力來(lái)篩選目標大分子；后者則是將人源抗體基因轉入小鼠體內，間接實(shí)現了“免疫人”。

這兩項技術(shù)終于把單抗的制備技術(shù)帶到了華山之巔，整個(gè)生物制劑領(lǐng)域有了一次飛躍，特別是后者，最早一批實(shí)現轉基因小鼠的Medarex為首個(gè)CTLA-4抑制劑和PD-1抑制劑鋪平了道路。

這兩種技術(shù)出發(fā)點(diǎn)都是實(shí)現全人源，不過(guò)各自的優(yōu)缺點(diǎn)也是很明顯。噬菌體展示技術(shù)基于大腸桿菌和噬菌體，生產(chǎn)速度是很快的——問(wèn)題也出在這里，咱們知道蛋白不是光氨基酸序列對了就行，三維結構也很重要，而噬菌體對蛋白三維折疊的加工顯然是不如真核細胞精細的，就算后來(lái)又發(fā)展出了酵母展示技術(shù)，也是沒(méi)法和哺乳動(dòng)物細胞比較。

另外，還記得咱們前面說(shuō)過(guò)的B細胞的幾個(gè)大殺器嗎，這套全自動(dòng)優(yōu)化流程噬菌體展示技術(shù)是代替不了的，想要得到高親和力的抗體，還需要進(jìn)行更加漫長(cháng)的篩選和人工改造。

轉基因小鼠技術(shù)的特點(diǎn)就與此完全相反了。相對來(lái)說(shuō)，給小鼠建立免疫的過(guò)程會(huì )較長(cháng)，但是抗體生成的大部分過(guò)程都是在體內進(jìn)行的，只要抗原暴露充分，就能夠得到親和性足夠高的抗體，就不需要繁瑣的“手動(dòng)”優(yōu)化了，而且這些抗體從理論上來(lái)說(shuō)跟人體產(chǎn)生的不會(huì )有很大差別。

所以我們怎么知道一個(gè)單抗好不好？

其實(shí)在一個(gè)單抗應用在患者身上之前，我們已經(jīng)能從其體外特征上大致看出它是否具有大展宏圖的潛力了。

以PD-1抑制劑為例，首先要具有能與PD-1高親和高特異性結合的可變區；其次功能上為了避免對靶細胞、也就是T細胞的毒性，應選用IgG4亞型；再次，IgG4抗體在體內會(huì )發(fā)生重鏈重組，S228P修飾能夠避免這個(gè)問(wèn)題讓抗體結構更穩定；最后，單抗的制備方法、也就是單抗來(lái)源，一定程度上能夠說(shuō)明它可能具有的免疫原性。（點(diǎn)這里復習誕生記）

在結構的基礎上，單抗在臨床前實(shí)驗中表現出的親和力、特異性、免疫原性、Fc段特征和功能性，這些就是我們評估單抗綜合實(shí)力的數據指標了。

抗體依賴(lài)與抗原的特異性結合發(fā)揮作用，最理想的情況肯定是每個(gè)抗體都能夠百分百結合抗原，發(fā)揮最大效能。以一當百喜聞樂(lè )見(jiàn)，以百當一就有點(diǎn)說(shuō)不過(guò)去了對不對。單抗的親和力到底有多強，直接影響到了藥物效果、臨床的最佳劑量和部分副作用程度。

單抗的親和力看的主要是兩個(gè)指標，EC50和IC50。

EC50指的是半數效應濃度，指的是藥物在引起50%最大效應變化時(shí)的濃度；IC50指的是半數抑制濃度，指的是某種抑制劑實(shí)現最大抑制效果50%時(shí)的濃度。在PD-1抑制劑這里呢，EC50和IC50關(guān)系到藥物與PD-1的結合能力和抑制PD-1與PD-L1/2結合能力。

說(shuō)得更通俗一些，這倆數值越小、抗體的親和力越高，那么臨床達標的最佳劑量就可能更低，副作用可能更小。

單抗藥物最大的優(yōu)點(diǎn)，就是當年P(guān)aulEhrlich提到的“魔法子彈”，只針對標靶絕不誤傷正常組織，一個(gè)讓打誰(shuí)就只打誰(shuí)的單抗才是好單抗。這一點(diǎn)可以通過(guò)免疫組化分析，來(lái)確定抗體是否對正常組織“出手”。

在今天涉及的四種藥物中，只有nivolumab對于其特異性作了詳細披露。原則上nivolumab特異性結合PD-1，不與其他免疫球蛋白超家族成員，例如CD28、CTLA-4等發(fā)生作用，研究者們通過(guò)免疫組化在多個(gè)人類(lèi)組織中證實(shí)了這一點(diǎn)。從結果來(lái)看，包括心、肝、肺、腎、脾、小腦等在內的多個(gè)組織都未出現特異性染色，只有垂體在20倍抗體濃度下表現出了低免疫活性，不過(guò)該組織并未檢出PD-1表達。

從某個(gè)角度來(lái)說(shuō)，單抗本身也可以被免疫系統當作是一種抗原，具有免疫原性，免疫系統有可能會(huì )產(chǎn)生抗藥物抗體（ADA）。

這顯然不是我們愿意看到的，一是ADA會(huì )加速單抗藥物的清除，這意味著(zhù)第一次使用有效的藥量很可能第二次就不夠用了，必須不斷增加使用量或頻次，直到最后完全沒(méi)用；二是如果免疫原性過(guò)強，很容易激起機體的過(guò)度免疫反應，帶來(lái)一系列副作用——可比打不過(guò)感冒病毒發(fā)燒流鼻涕嚴重多了。

ADA也和我們體內的其他抗體一樣分為好幾類(lèi)，其中對藥效影響最大的就是中和抗體。

從臨床數據來(lái)看，CA209066研究中107位患者中僅有6位（5.6%）患者出現ADA，其中未檢測出中和抗體；綜合6項臨床研究的數據，也僅有0.3%的患者持續表現出ADA陽(yáng)性。而且無(wú)論ADA還是中和抗體，它們的存在都與超敏反應、輸注反應或藥物失效無(wú)關(guān)，可以認為nivolumab在臨床上是沒(méi)有免疫原性的。

另一方面，pembrolizumab臨床試驗中1289名患者有26名（2.01%）出現ADA，這26位患者中有4位進(jìn)行了中和抗體檢測，顯示1位中和抗體陽(yáng)性。

不過(guò)免疫原性在臨床上受到藥物本身、儲存方法、患者條件、檢測方法等多因素影響，這方面很難直接對比。

對PD-1抑制劑來(lái)說(shuō)，對Fc段的要求有些特別。大部分治療性單抗的目的都是結合抗原抓住致病原，誘導免疫細胞殺敵，前者通過(guò)CDR的特異性識別實(shí)現，后者則是通過(guò)Fc段結合免疫細胞實(shí)現的。但是PD-1抑制劑不同的點(diǎn)在于，它結合的標靶PD-1是位于T細胞上的，但PD-1抑制劑可不是來(lái)消滅T細胞的。

于是，為了避免同類(lèi)相殘的慘劇，PD-1抑制劑的制備選用的大都是IgG4型抗體。這個(gè)亞型很溫柔，其天然的抗體依賴(lài)的細胞毒性（ADCC）很弱，補體依賴(lài)的細胞毒性（CDC）也幾乎沒(méi)有，如果再加以一些修飾能夠去除這兩大項作用就更加完美了。是否有ADCC和CDC存在，也是衡量PD-1單抗效果的指標之一。

Fc段特征在評價(jià)PD-1單抗方面還是很重要的，會(huì )直接影響到T細胞的工作效率or存亡與否。

PD-1抑制劑的最終目的是解放T細胞的潛能、讓它去殺癌細胞。在這一點(diǎn)上，一方面IFN、IL等細胞因子的釋放已經(jīng)被證實(shí)與T細胞激活有關(guān)，另一方面，觀(guān)察實(shí)驗動(dòng)物體內腫瘤的生長(cháng)情況也是很好的選擇。我們不妨對已披露數據一探究竟。

對健康供者細胞進(jìn)行的實(shí)驗證實(shí)，在有抗原刺激的條件下，低濃度的nivolumab就能夠顯著(zhù)增加T細胞的增殖，并促進(jìn)IFN-γ和IL-2的釋放，同時(shí)并不會(huì )導致非特異性淋巴細胞的激活。

JS-001的功能實(shí)驗顯示其能有效刺激T細胞增殖和IFN-γ、TNF-α釋放，同時(shí)還與nivolumab進(jìn)行了橫向比較?？梢?jiàn)JS-001功能性與劑量相關(guān)性更大，較高劑量時(shí)細胞因子水平更高；而nivolumab的發(fā)揮更“穩定”，極低劑量也能達到一定效果。

功能性實(shí)驗可以說(shuō)是對前述體外特征的進(jìn)一步驗證。

總的來(lái)說(shuō)，單抗藥物的結構設計是決定其功能效應的先決條件。面對一款PD-1單抗，我們只有把牢其最基本的評價(jià)原則——從親和性、特異性、免疫原性、Fc段特征入手，結合其在功能性實(shí)驗上的表現，才能初步判斷它是否具有一飛沖天的潛力。

這些特征在臨床上也是能被進(jìn)一步證實(shí)的，比如nivolumab的臨床數據顯示，nivolumab與PD-1的結合似乎不依賴(lài)于劑量，首次用藥后4-24小時(shí)即出現平均峰值85%，這與nivolumab在體外表現出的高親和性是一致的。

追本溯源，回歸原點(diǎn)。只有從最開(kāi)始了解PD-1單抗的臨床前特征，才能幫助我們真正慧眼識英雄。